免疫印跡膜剝離和重新檢測

 

免疫印跡是研究蛋白質功能和定位的常用技術。通常，蛋白質樣品可在SDS-PAGE上分離并轉印至硝酸纖維素膜(NC膜)或PVDF膜上，然后用特異性抗體進行檢測。與可重復利用Southern和Northern印跡的核酸技術不同，免疫印跡很難重復使用。

 

免疫印跡的剝離和重新檢測技術具有以下幾個優點：

1.有利于昂貴或量少或珍稀樣本的多次雜交；

2.有利于用不同抗體分析單次印跡上的不同蛋白，比如不同亞型的抗體；

3.有利于對異常結果進行重分析或確認；

4.有利于糾正孵錯的抗體；

5節約試劑成本，并節約時間。

 

目前已經公布了幾種用于從免疫印跡上剝離抗體的方案，包括低pH、加熱和去垢劑以及離液劑等方法。以下是三種推薦方案。第一種方案適用于任何化學發光底物系統，即通過加熱和去垢劑的組合來解離抗體。第二種常用于抗體必須與抗原分離的應用，即采用低pH值來改變抗體的結構，使結合位點失活。

第三種方案利用具有特殊配方的Western Blot Stripping Buffer（蛋白質印跡剝離緩沖液）從免疫印跡膜上剝離抗體。該方法的優勢在于：

• 避免吸入與β-巰基乙醇有關的刺激性氣味。

• 可在室溫條件下處理。

• 可在15分鐘內剝離抗體。

這些方法都不能去除顯色檢測系統所產生的有色沉淀（如BCIP、4CN、DAB和TMB）。但是，仍可以利用靶向不同目標蛋白的另一種抗體來分析印跡。

通常，這些方案僅能用于定性用途，除非已經確定剝離過程不會影響指定抗原的定量結果。許多抗原將經歷至少5次剝離循環，具體取決于所用的方法和膜類型。但是，應該考慮到在每個剝離循環中，都將洗去少量的膜固定蛋白。如果需要連續檢測幾種抗原，建議從預期豐度較低或產生信號較少的抗原開始。

 

在設計具有一輪或多輪抗體剝離的免疫印跡實驗時，可參考以下建議。

• PVDF膜比硝酸纖維素膜更堅韌，因此推薦用于任何涉及抗體剝離的方案。

• 從SDS-PAGE凝膠轉印完成后立即干燥PVDF膜，可改善蛋白質與膜的結合，特別推薦用于涉及多次剝離的實驗。在第一輪免疫檢測之前，必須使用乙醇將干燥的PVDF膜潤濕。

• 優先檢測低豐度抗原。

• 先使用親和力低的抗體，再使用高親和力抗體。

重要提示：盡管建議在轉印后立即干燥PVDF印跡，但不可在兩輪免疫檢測之間干燥印跡，否則，任何殘留的抗體分子將與膜永久結合。

 

方案1：通過加熱和去污劑剝離

所需設備和溶液

• 標準印跡或印跡條，在硝酸纖維素或PVDF膜上。

• 封閉液。

• 剝離溶液：100 mM 2-巰基乙醇 (M301574)、2% (w/v) SDS (S108346)、62.5 mM Tris-HCl (T105291), pH 6.7。

• 磷酸鹽緩沖鹽（PBS）：10 mM 磷酸鈉、pH 7.2，0.9%（w/v）NaCl。

• 淺托盤，能容納膜

• 陽性和陰性剝離對照。

操作流程

1.在通風櫥內，將印跡放入剝離溶液中，50 °C搖動孵育30分鐘。

2.將印跡放入緩沖液中，搖動10分鐘。使用新鮮的緩沖液重復一次。

3.可選: 重復初始檢測操作（省略一抗步驟），

4.以確保抗體已失活或從膜上剝離。

5.將印跡放入緩沖液中，搖動10分鐘。

6.繼續進行封閉步驟，進行下一輪的免疫檢測。

 

方案2：通過低PH值剝離

所需設備和溶液

• 標準印跡或印跡條，在硝酸纖維素或PVDF膜上。

• 封閉液。

• 剝離溶液：25 mM 甘氨酸-HCl (G156794), pH 2,1% (w/v) SDS (S108346)。

• 磷酸鹽緩沖鹽（PBS）：10 mM 磷酸鈉、pH 7.2，0.9%（w/v）NaCl。

• 淺托盤，能容納膜

• 陽性和陰性剝離對照。

操作流程

1.將印跡放入剝離溶液中，搖動孵育30分鐘。

2.將印跡放入緩沖液中，搖動10分鐘。使用新鮮的緩沖液重復一次。

3.繼續進行封閉步驟，進行下一輪的免疫檢測。

 

方案3：利用WESTERN BLOT STRIPPING BUFFER（蛋白質印跡剝離緩沖液）

抗體剝離液對硝酸纖維素和PVDF膜均具有良好的剝離效果。但在待剝離膜具有較高信號或抗體剝離液體處理不充分時效果更好。

所需設備和溶液

• 標準印跡或印跡條，在硝酸纖維素或PVDF膜上。

• 封閉液。

• 保鮮膜，用于保存不會立即再次檢測的印跡。

• Western Blot Stripping Buffer（蛋白質印跡剝離緩沖液）

• 蒸餾水，用于稀釋試劑。

• 淺托盤，能容納膜

• 陽性和陰性剝離對照。

操作流程

注意：若要重復使用印跡或單個印跡條，應在第一次使用后立即剝離。如果不能立即剝離，應將膜包在保鮮膜中并置于PBS中，保存在4°C。切勿將印跡干燥保存。

1.在塑料托盤中加入適量的1X Antibody Stripping Solution（緩沖液套餐中提供）

2.用鑷子將印跡或印跡條浸入剝離液中。在室溫下，輕輕混合孵育15分鐘。在一個干凈的塑料托盤中裝入相同量的封閉液。

3.可使用傳統的封閉液，如20 mM Tris HCL、pH 8.0，150 mM NaCl，0.1% 吐溫20，5%奶粉，或者類似溶液。

4.使用封閉液清洗印跡2次，每次5分鐘。

5.現在，可使用抗體再次檢測印跡。

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參考文獻

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4.Kaufmann SH, Ewing CM, Shaper JH. 1987. The erasable Western blot. Analytical Biochemistry. 161(1):89-95. http://dx.doi.org/10.1016/0003-2697(87)90656-7

5.Yeung Y, Stanley ER. 2009. A solution for stripping antibodies from polyvinylidene fluoride immunoblots for multiple reprobing. Analytical Biochemistry. 389(1):89-91. http://dx.doi.org/10.1016/j.ab.2009.03.017

 

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膜剝離 免疫印跡

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