用糖苷酶編輯治療性蛋白質上的糖鏈

 

 

 

什么是蛋白質糖基化

 

 

 

真核生物蛋白質最常見的翻譯后修飾之一是糖基化。蛋白質的糖基化可以影響許多生物活性。對于治療性糖蛋白，它可以改變生物活性、靶向性、轉運、血清半衰期、清除性和受體的識別[1,2]。出于這樣的原因，生物制造廠商必須監測和表征他們的重組治療蛋白的糖基化模式>[3,4]。治療蛋白有兩種主要的糖基化類型：N-連接的糖鏈和O-連接的糖鏈[5]。N-糖鏈的附著始于內質網(ER)，在內質網中，核心的新生多糖通過蛋白質的特定天冬酰胺（產品號：F141104）殘基上的側鏈酰胺氮連接在具有NXS/T序列的位置，其中X可以是除脯氨酸（產品號：P111001）以外的任何氨基酸殘基。當糖蛋白通過內質網和高爾基體時，N-糖鏈被修剪和進一步修飾。宿主細胞和細胞培養條件可以改變糖蛋白上存在的N-糖基化類型(從高甘露糖到復雜和雜交的N-糖鏈)。O-糖基化發生在高爾基體中。N-葡聚糖有一個共同的核心，由兩個N-乙酰氨基葡萄糖（產品號：N355747）(GlcNAc)殘基和三個甘露糖(Man)殘基組成。但O-葡聚糖唯一的共同核心是N-乙酰半乳糖胺（產品號：N389642）(GalNAc)殘基，它通過蛋白質的絲氨酸（產品號：S329534）或蘇氨酸殘基的側鏈上的氧原子連接。
 

 

糖苷酶:糖基化是復雜的和異質性的，所以必須使用多種分析方法來確定糖鏈的結構和它們在糖蛋白上的位置。糖苷酶是重要的工具，通常與其他分析方法一起使用，以去除、修剪或修飾多糖。糖苷酶(糖苷水解酶)（產品號：G128643、N159659、A109181）是一種能分解復合糖的糖苷鍵的酶。這些酶應用于治療性糖蛋白的三個主要分析領域：去除用于分析的葡聚糖、修剪用于測序的葡聚糖和在糖工程中修飾葡聚糖。在這里，我們描述了在每個領域中使用的不同的酶，以及它們的應用的具體例子。
 

 

提取用于分析的多聚糖

 

 

從糖蛋白中去除N-糖鏈最常用的酶是多肽-N-糖苷酶F(PNGase F)（產品號：P420186）。它是一種酰胺酶，在N-糖鏈最里面的GlcNAc殘基和天冬酰胺殘基之間裂解，釋放N-糖鏈，從而在蛋白質上產生天冬氨酸（產品號：A329587）殘基而不是天冬酰胺殘基。糖苷酶如此頻繁使用的一個主要原因是它們具有非常廣泛的特異性，可以裂解高甘露糖、復雜的和混合的N-糖鏈。這種酶的唯一限制是，如果有α1-3巖藻糖連接到核心GlcNAc殘基(蛋白質旁邊的糖殘基)，就不能切割。這種修飾只發生在植物、昆蟲、軟體動物和寄生蠕蟲中。含有這種修飾的N-葡聚糖可以被PNGase A酶去除。一旦N-葡聚糖被酰胺酶釋放，就可以對其進行流動標記，以供液相色譜-熒光檢測(LC-FLD)或質譜(LC-MS)或毛細管電泳聯用激光誘導熒光檢測(CE-LIF)分析。圖1說明了PNGase F從Erbitux治療性抗體(西妥昔單抗)中釋放的N-糖鏈的種類，并通過LC-MS分析進行了檢測。

 

 

 

除了PNGase F，許多不同的內切-β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶也從糖蛋白中釋放N-糖鏈。大多數內切糖苷酶僅限于它們能識別和切割的N-糖鏈類型。表1顯示了大多數商業上可獲得的內切-β-N乙酰氨基葡萄糖苷酶的不同特性。所有這些內切糖苷酶都能水解N，N’二乙酰殼寡糖部分(位于N-糖核上的兩個GlcNAc殘基之間)，使GlcNAc殘基附著在蛋白質上。因此，它們經常被用來確定N-聚糖在特定部位的占有率或存在情況。這對具有多個N-糖基化位點的糖蛋白特別有用。

 

通常情況下，糖蛋白先用內切糖苷酶消化，然后用蛋白酶（產品號：P298993）裂解。然后用MS分析這些多肽片段。任何肽片段上單個GlcNAc殘基的額外質量證實該位置被N-糖鏈占據[6]。由于內切-β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的水解點遠離蛋白質骨架，因此在非變性條件下，這些酶通常能裂解N-糖鏈。即使這些位點在相似的自然條件下不能切割PNGase F，也會發生這種情況。對于Endo S尤其如此，它專用于對免疫球蛋白Fc區N-糖鏈的水解，并且偏愛非變性條件。當目標是保存蛋白質的結構時，這種內切糖苷酶在自然條件下水解糖的能力特別強。
 

 

 

目前，還沒有已知的廣譜特異性內切糖苷酶能將所有O-糖鏈從糖蛋白中分離出來。因此，O-糖鏈的分析比N-糖鏈的分析要困難得多。有兩種O-糖苷酶可以在市場上買到。一種來自肺炎鏈球菌，可以釋放核心1二糖，由連接β1-3的半乳糖(Gal)和N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)組成，其中GalNAc殘基與蛋白質的絲氨酸或蘇氨酸（產品號：T108221、T100459）殘基相連[7]。另一種O-糖苷酶來自糞腸球菌，具有稍寬的專一性，將核心1二糖和核心3二糖都裂解，其中核心3二糖由β1-3連接到GalNAc[8]。如果雙糖被唾液酸或其他糖進一步修飾，兩種酶都不能裂解。使用β消除法可以化學釋放完整的O-葡聚糖，但必須注意這種方法不能降解釋放的葡聚糖（產品號：D140049等）。

 

 

 

這種方法的另一個主要缺點是蛋白質被破壞，不能再分析其結構或活性。與O-葡聚糖的完整化學釋放相比，可以使用外切糖苷酶和O-糖苷酶的組合來修剪O-葡聚糖(圖2)。雖然這種方法可以保留蛋白質的結構和活性，但它會降解多糖，因此無法對其進行表征。此外，一些O-葡聚糖含有糖類修飾(例如，硫化或乙?；?，使修飾后的糖不被外切糖苷酶切割。
 

 

 

 

修剪糖鏈以進行測序

 

 

胞外糖苷酶是一種重要的酶，它可以一次一個糖殘留物地將多聚糖從多聚糖的非還原末端去除。商業上有大量不同的外切糖苷酶。胞外糖苷酶對糖的類型及其異構體(α或β)都是特異的。一些外切糖苷酶比較普遍，可以分解許多不同的連接。例如，廣特異性神經氨酸酶（產品號：N128387）可以去除連接到糖鏈上的α2-3、α2-6、α2-8或α2-9上的唾液酸殘基。其他外切糖苷酶對特定的連鎖更具專一性。例如，β1-4半乳糖苷酶只能去除β1-4連接的半乳糖。由于這些酶的先天專一性，外切糖苷酶對修剪糖鏈和確定糖鏈的序列都很有用。基本的LC-MS或基質輔助激光解吸/電離(MALDI)分析只能確定多糖的大小。然而，為了確定多糖上存在的單糖的連接或類型，有必要進行串聯質譜儀(MS-MS)，例如碰撞誘導解離(CID)或使用外切糖苷酶，然后進行CE或MS分析。
 

 

 

當使用外切糖苷酶時，重要的是要考慮酶制劑的質量。從天然來源分離的酶制劑往往會被其他糖苷酶活性污染，這使得多糖結構的闡明變得更加困難。最常用的外切糖苷酶的重組測序級版本現在可以在商業上用于敏感的葡聚糖分析工作流程。

 

 

 

 

圖3顯示了糖苷酶如何對從Enbrel治療蛋白(依那西普)釋放的多糖進行測序。胞外糖苷酶也可以用來對仍然附著在糖蛋白上的糖鏈進行測序。這些酶對于分析和檢測糖鏈上潛在的抗原結構特別有用。例如，使用通用的α-半乳糖苷酶，如來自綠咖啡豆的酶來處理治療性蛋白質，可以幫助識別低水平的半乳糖α1-3Gal(α半乳糖表位)，這些半乳糖苷酶在人類中不存在，并且可以產生免疫原性[9]。

 

 

葡聚糖的改性

 

 

除了去除完整的糖鏈和進行糖鏈測序外，糖苷酶還可用于修飾糖蛋白上的糖鏈[10](稱為糖工程)。一種方法是使用內切糖苷酶去除不需要的N-連接的多糖。然后，通過內切糖苷酶裂解留下的GlcNAc殘基，可以將通過化學酶合成產生的所需的均勻的葡聚糖連接到糖蛋白上。可以使用內切糖苷酶(自然地轉糖基化)，如Endo-M[11]，或使用內切糖苷酶突變體來實現所需的葡聚糖的連接，該酶突變體可以驅動反應朝向添加糖而不是去除糖的方向發展[12](圖4)。


 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

糖工程的另一種方法是使用外切糖苷酶將糖蛋白上的糖鏈修剪成統一的大小。然后，可以使用特定的糖基轉移酶（產品號：G293642）來重建這種多糖，這種轉移酶將單糖從核苷酸糖供體轉移到糖鏈上。這會產生一種糖蛋白，具有更均一的糖鏈結構(圖5)。



未來的應用

 

 

到目前為止，這些體外糖工程方法大多是小規模使用的。用于治療溶酶體儲存疾病的糖蛋白酶是個例外。這些酶中的幾種已經被糖工程利用外糖苷酶暴露蛋白質上的甘露糖結構，以通過受體介導的內吞作用改善酶向溶酶體的運輸[13]。此外，宿主細胞中糖基化途徑的修飾正被用于生產具有所需糖基化的治療性蛋白質。這些細胞系的治療性蛋白質生產正在順利進行，有幾種治療性蛋白質正在進行臨床試驗?？茖W家們預計，隨著對高通量方法的需求增加，葡聚糖分析的速度和簡單性將隨著酶和分析的進一步改進而進步。新的抗體特異性蛋白水解酶，如IDES和IDEZ，是對典型的抗體胰酶/溶菌酶C或木瓜酶（產品號：P128675、P128674）消化抗體的改進，因為它們特異性地切割在抗體的鉸鏈區域，而不是次級位點切割。使用這些酶和改進的軟件，可以對抗體的恒定區進行MS分析。這使得能夠確定FC上存在的多糖的類型，而不需要移除、純化和標記N-聚糖。其他方面的改進可能會導致發現新的酶特異性。例如，一種對復雜O-葡聚糖具有廣泛專一性的酶可以更好地分析這些類型的蛋白質修飾。隨著更多的治療性蛋白在轉基因植物和昆蟲細胞系中表達，可以去除所有N-糖鏈的PNGase將非常有用。最后，隨著葡聚糖分析方法變得更精細，更高的吞吐量和更高的靈敏度，在開發過程中應該可以選擇克隆，或者使用選擇的糖工程表達宿主來產生具有所需糖基化模式的抗體。這樣的速度和靈敏度還將允許對發酵過程進行持續監測，這將提高治療性糖蛋白的生產。

 

 

 

參考文獻：

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葡聚糖 糖基化 天冬氨酸 糖苷酶 蛋白酶

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